Резюме
МРНК Brca1 було виявлено у тканині молочної залози самок мишей дорослих незайманих жінок під час вагітності та ранньої лактації. Це було пов'язано з фазами проліферації та диференціації епітеліальних клітин молочної залози, але модель експресії Brca1 була невід'ємною від схеми справжнього маркера диференціації, β-казеїну, завдяки його значній експресії в незайманій залозі та припиненню її експресії в ранньому дитинстві. . У первинній моделі культури клітин асоціація багатоклітинного позаклітинного матриксу (ECM) з клітинами епітелію молочної залози потрібна для виживання клітин та диференціації клітин та пригнічення експресії Brca1 у цих клітинах. Асоціація ECM може суттєво сприяти остаточному обмеженню експресії Brca1 в лактуючій залозі у природніх умовах . Цікаво, що наші результати свідчать про те, що епітеліальні клітини молочної залози піддаються апоптозу, коли вони експресують і коли вони не експресують Brca1, залежно від того, чи є остаточно диференційовані популяції відмираючих клітин.
Доступ надано
Вступ
Brca1 виконує одну або кілька основних функцій у ранньому ембріогенезі і, як видається, необхідний для ембріональної проліферації та розвитку зародкових шарів та нервових структур. 38, 40, 41, 42. Дефіцит клітинної проліферації лежить в основі неможливості вижити нуль-ембріонів Brca1 (і Brca2), крім того, припускається їх надмірною експресією інгібітора циклінозалежної кінази p21/Waf1. 41, 43 Експресія Brca1 у кількох ділянках органогенезу в пізньому ембріогенезі та в різних тканинах дорослих, таких як тимус, яєчко, епітелій молочної залози та фолікули яєчників, свідчить про вплив на продукт (и) цього гена в одному або декількох фундаментальних процесах розвитку, і це виражається в місцях розповсюдження, де незабаром настане диференціація. Крім того, експериментальне пригнічення експресії BRCA1 спричинило прискорений ріст нормальних та злоякісних епітеліальних клітин молочної залози, але не епітеліальних клітин немолочних залоз, надмірна експресія BRCA1 45 спричинила затримку росту in vitro, особливо клітинних ліній пухлини молочної залози та яєчників. 46
Повідомлена експресія Brca1 у постнатальному епітелії молочної залози під час статевого дозрівання та вагітності 37, 44 свідчить про те, що генний продукт функціонує в проліферуючих та/або диференційованих клітинах. На сьогоднішній день повідомляється, що транскрипція молочної залози гена Brca1 є високою в середині та пізній термін вагітності, здається, зменшується під час лактації та ранньої інволюції, але знову стає помітною через 5 - 7 днів після відлучення. Експресія 37,44 Brca1 підвищується в культивованих клітинах від G1/S до M47, що знову вказує на роль у проліферації. Експресія людського гомолога, BRCA1 та BRCA2, схоже, схожа на регульований клітинний цикл із підвищеним рівнем мРНК у пізній фазі G1/S, що передує синтезу ДНК, у культивованих клітинах. 15, 48, 49 Кінетика регуляції експресії Brca1 під час активності епітелію молочної залози в період статевого дозрівання та вагітності відображається у Brca2. 39, 47
Результати
Аналіз усього кадру 50 молочної залози дорослої миші (рис. 1А) виявляє ріст протокової та альвеолярної систем від незайманого стану, від вагітності до повного розвитку лактації: в середині вагітності спостерігалося рясне протокове розгалуження та сильний початковий альвеолярний розвиток . . У грудному віці досягнуто повного розвитку альвеол і спостерігається максимальна колонізація всієї жирової подушки. Ці події відображають хвилі проліферації епітеліальних клітин під час вагітності та ще на початку дитинства. Відлучення викликає початок інволюції, що включає послідовно застій молока в альвеолах, фазу інтенсивного апоптозу клітин альвеолярного епітелію і, нарешті, фазу зменшення ремоделювання залози, що пов'язано зі значною активністю металопротеази місцевого матриксу. 52, 53 Повне 4-денне мимовільне кріплення залози демонструє значну альвеолярну регресію, і це триває з часом (рис. 1А, результати не показані).
Повнорозмірне зображення
Малюнок 1С демонструє специфічність вимірювання ПЛР Brca1; на першій панелі показано перетравлення продукту RT-PCR на передбачуваному унікальному внутрішньому сайті Ear1 (див. мультфільм); друга панель показує результат Саузерн-блот продуктів травлення Ear1 та цільової ДНК за допомогою внутрішнього зонда, який виявляє цільову смугу ДНК та продукт 303 bp, як і передбачалося. На третій панелі показаний результат вкладеного ПЛР із: первинним продуктом ПЛР (535 п.н.) як шаблоном; олігонуклеотид "Південний зонд" як прямий праймер і використовуючи первинний зворотний праймер ПЛР. Це генерує одну смугу 366 bp, як очікувалося (смуги 4 і 5). Тому ми оцінюємо наші продукти Brca1 RT-PCR за зразками тканин та первинних культур клітин, щоб достовірно відображати клітинні транскрипти Brca1.
Повнорозмірне зображення
Підсумовуючи, наші результати приводять нас до трьох основних висновків: (1) що експресія Brca1 в обох досліджуваних модельних системах, in vivo та in vitro (первинна культура клітин), головним чином пов’язана з проліферацією клітин; (2) Те, що експресія Brca1 в обох досліджуваних модельних системах пригнічується в повністю диференційованій, "виживаючій" епітеліальній клітині молочної залози; Вперше було показано, що клітинна взаємодія з багатим ламініном ECM є критично важливою для цієї репресії; та (3) що експресія Brca1 у популяціях епітеліальних клітин молочної залози, здійснених до апоптозу, може відрізнятися залежно від фізіологічного стану клітин: коли апоптотична популяція раніше була пов'язана з ECM, не спостерігається експресії Brca1; де апоптотична популяція не асоціюється з матрицею, експресія Brca1 зберігається.
Обговорення
Матеріали і методи
Розсічену тканину молочної залози від наївних (5 тижнів), вагітних та годуючих мишей CD1 миттєво заморожували у рідкому азоті та зберігали при -70 ° C для подальшого приготування РНК. Четверта молочна (пахова) залоза була використана для фіксації метакарну та пофарбованого кармалом препарату, як описано Edwards et al. 50 первинних культур епітеліальних клітин молочної залози 59, 74, 75 були приготовані з молочних залоз вагітних мишей CD-1 на 14–19 день, як нещодавно описано. 57 Після вирощування в умовах проліферації протягом 48 год популяції `` апоптотичних клітин (`` менше ECM '') культивували в відсутність сироватки та EGF та відсутність ECM (Matrigel), але в присутності лактогенних гормонів та `` вижили/диференційовані клітини ('більше ECM') ', культивовані у відсутності сироватки та EGF, але в присутності ECM (ECH, отриманого з пухлини ECM, Matrigel (Becton Dickinson)) та лактогенних гормонів. 57 Потім вони були зібрані для аналізу клітинного циклу FACS, FACS/TUNEL та загальної ізоляції РНК та аналізу RT-PCR. Аналіз клітинного циклу FACS проводили, як нещодавно було описано. 57
Скорочення
ген сприйнятливості до раку молочної залози 1
позаклітинний матрикс
Активоване флуоресценцією сортування клітин/опосередковане TdT Біотильоване dUTP Кінцеве маркування