- предметів
- методи
- Розчин мікропузирків/плазміди та вірусні вектори
- Катетеризація тварин та слинних залоз
- Відображення Luc у природніх умовах
- Кількісна оцінка передачі генів та статистичний аналіз
- гістологія
- Автори
- Шукати MJ Passineau у:
- Шукати L Zourelias у:
- Шукати L Machen у:
- Шукати PC Edwards у:
- Шукати RL Benza у:
предметів
- Доставка генів
- УЗД
- Оригінальна стаття була опублікована 27 травня 2010 року
Виправлення: Генна терапія (2010) 17, 1318 - 1324; doi: 10, 1038/gt.2010, 86
З моменту публікації цієї статті автори виявили, що існує кілька випадків, коли мікрограми публікувались у міліграмах у розділі Методи. Правильна частина Методу наведена нижче.
методи
Розчин мікропузирків/плазміди та вірусні вектори
Остаточні мікропухирці були придбані у вигляді ін’єкційної суспензії об’ємом 2 мл та активовані за допомогою пристрою Vialmix згідно з інструкціями виробника (Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA, США). Мікробульбашки використовували для експериментів протягом 30 хвилин після їх активації. Загалом 50 мкг pCMV-GL3 (плазміда, що експресує GL3 Luc, сконструйована шляхом вставки промотору цитомегаловірусу (CMV) в pGL3-основний сайт багаторазового клонування; Promega, Madison, WI, США) змішували з 50 мкг. розчин мікробульбашок, або 100, або 15% розчин вводу/виводу з забуференним фосфатом сольовим розчином.
Для опосередкованого Ad перенесення генів був створений нереплицирующийся вектор Ad Serotype 5 на основі системи Stratagene AdEasy шляхом клонування послідовності GL3 (з базового вектора Promega pGL3 Basic) у сайт множинного клонування вектора pShuttle-CMV (Stratagene, Ла-Холла, Каліфорнія, США). Човниковий вектор рекомбінували в хребетну кістку AdEase, і отриманий вектор, Ad-CMVGL3, ампліфікували та очищали до титру від 3,5 до 1012 vp мл-1. Вектори реклами подавали в 50 мкг сольового розчину, забуференного фосфатом.
Катетеризація тварин та слинних залоз
Мишей C57BL/6 отримували з лабораторії Jackson Labs (Bar Harbor, ME, США) та утримували у вільних від патогенів умовах у віварії Науково-дослідного інституту Аллегені-Зінгера, маючи доступ до стандартних продуктів харчування та води за бажанням. Експерименти на тваринах та протоколи були розглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду за тваринами та їх використанням Науково-дослідним інститутом Аллегені-Зінгера. Перенесення генів у слинні залози відбувається, як це вже описано Вутетакісом та його колегами. 4 Коротко кажучи, тварину знеболили та помістили у стереотаксичну рамку, щоб паща залишалася відкритою. Ручку втягнули, а тонкий пластиковий катетер помістили у отвір підщелепного каналу з одного боку, рухаючи
1 см і утримується на місці за допомогою клею. Загалом 50 мкг розчину транспортного засобу, що містить вектор переносу гена (вірус або плазміда/мікробульбашки), вводять катетером в канал з одного боку, а поршень залишають на місці на 10 хвилин, щоб дати контакту вектора епітелії слини. клітин. Потім катетер виймали, і тварина поверталося до своєї клітки, щоб нормально прокинутися.
В експериментах з перенесення генів ультразвуком шкіру, яка безпосередньо лежить над слинною залозою, обробляли депіляційним засобом, застосовували комерційний ультразвуковий гель, а випромінювач ультразвуку (SoniGene, VisualSoincs Inc., Торонто, Онтаріо, Канада) безпосередньо контактував з шкіра перекриття. Після вливання розчину плазміди з мікропухирців застосовували імпульси 4 х 30 с за таких параметрів: 1 МГц, 50% робочого циклу і 2 Вт см-2, з 10 с між імпульсами. Після чотирьох імпульсів опромінювач зняли, і тварині дали відпочити протягом 10 хвилин, перш ніж видалити катетер.
Візуалізація Luc in vivo
Мишам вводили внутрішньом’язово 1 мл на г маси тіла кетаміну (20 г мл-1)/ксилазину (100 мг мл-1), змішаного у співвідношенні 3: 2. Після анестезії миші внутрішньочеревно вводили D-люциферин субстрат (XenoLight D-калієвий люциферин, Caliper Life Sciences, Хопкінтон, Массачусетс, США) у дозі (100 мкл на 10 г маси тіла, 15 мг мл-1 запас). Потім мишей поміщали в світлонепроникну камеру і генерували зображення протягом 1 хвилини експозиції за допомогою кріогенно охолодженої зарядної камери IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences) для кількісної оцінки фотонів, спонтанно випромінюваних твариною. Зображення були псевдокольоровими за допомогою програмного забезпечення Xenogen (Caliper Life Sciences) і накладалися на чорно-білу фотографію тварини, створену підсвічуванням кабінету. Візуальний вихід представляє кількість фотонів, що випромінюються за секунду на см 2 у вигляді псевдокольорового зображення, в якому максимум - червоний, а мінімум - фіолетовий.
Кількісна оцінка передачі генів та статистичний аналіз
Зображення, отримані за допомогою зображень in vivo, аналізували за допомогою програмного забезпечення Living Image (Caliper Life Sciences). Фотони, що випромінюються із слинної залози, визначались кількісно, визначаючи NI над анатомічним положенням слинної залози. У більшості випадків ця рентабельність інвестицій генерувалась автоматично за допомогою програмного забезпечення "Автоматична контурна рентабельність інвестицій", а загальний потік (квантів на секунду) вимірювався в області рентабельності інвестицій. У випадках, коли програмне забезпечення не могло забезпечити автоматичну рентабельність інвестицій або якщо не було впізнаваного сигналу, коло діаметром приблизно 0,75 см розміщували над анатомічним положенням слинної залози і вимірювали загальний потік. Ми постійно виявляли, що фонове значення 3 × 104 було фоновим значенням у цій системі. Однак у таблицях значення відображалися як загальний потік, без фонової корекції.
гістологія
Щоб дослідити можливі відмінності у сіалоаденіті, спричинені двома гострими методами доставки генів, ми здійснили передачу генів у другій когорті тварин за допомогою методів, ідентичних описаним вище, за винятком того, що половина тварин у цій когорті були самками, причому статі були рівномірно розташовані розділити між групами оголошень та групами UAGT. Тварин забивали через 7 днів, а слинні залози видаляли, фіксували, вкладали в парафін, розрізали на мікротоми і фарбували гематоксиліном та еозином. Сліпий патолог ротової порожнини (PCE) дослідив предметні стекла та класифікував ступінь сіалоаденіту за шкалою від 1 (норма) до 4 (важка, з повним руйнуванням ацинарних клітин) на основі модифікації Isacsson et al. 24
Для вивчення просторового розподілу плазмідних/мікропузиркових векторів та результуючої експресії трансгену ми запропонували pCMV-GFP, експресуючу GFP плазміду, таким же чином, як описано вище, використовуючи 15% розчин носія мікробульбашок. Безпосередньо перед інфузією суміші плазміда/мікробульбашки, а потім ультразвукові зображення слинних залоз отримували на VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc., Торонто, Онтаріо, Канада) зі скануючою головкою RMV-704, що працювала в режимі B при 40 Через 7 днів тварин забивали, а слинні залози видаляли, фіксували та вкладали у парафін. Зрізи тестували за допомогою флуоресцеїн-ізотіоціанат-кон’югованих анти-GFP-поліклональних антитіл (Abcam, Cambridge, MA, USA).
Автори хотіли б вибачитися за цю помилку.